Ekstraksi Asam Nukleat
Ekstraksi asam nukleat (DNA dan RNA) dari berbagai bahan biologis untuk digunakan dalam analisis molekuler berikutnya merupakan langkah paling penting dalam biologi molekuler. Metode isolasi asam nukleat dapat dikategorikan menjadi 3 metode: ekstraksi organik (fenol/kloroform), metode ekstraksi anorganik (penggaraman) dan metode ekstraksi fase padat (matriks padat).
Dalam mencapai proses isolasi asam nukleat yang benar, terdapat 4 langkah yang umumnya diperlukan untuk purifikasi asam nukleat tersebut:
- Lisis sel melalui proses disrupsi membran dan/atau sel (atau kista)
- Dehidrasi dan presipitasi protein seluler (denaturasi protein)
- Pemisahan protein dan komponen seluler lainnya dari asam nukleat
- Presipitasi dan pelarutan asam nukleat
Tahapan lisis sel rutin dapat dibagi menjadi tiga jenis bergantung pada jenis jaringan yang berbeda:
- Penggilingan jaringan hewan atau tumbuhan dalam nitrogen cair dengan mortar dan alu
- Penggilingan glass-bead untuk ookista, metaserkaria dan telur nematoda
- Pemipetan berulang untuk sel hewan dan zoit parasit (sporozoit, merozoit, takizoit dan bradizoit, tripanosoma, tripomastigot, promastigot, amastigot dan epimastigot).
Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi pengembangan teknik molekuler telah menciptakan kebutuhan untuk memunculkan metode baru ekstraksi DNA dan RNA yang lebih sederhana dan efisien untuk amplifikasi PCR dan uji lainnya. Menghindari adanya karbohidrat, tanin, polifenol dan protein selain pelarut organik berbahaya (fenol dan kloroform) merupakan kunci utama keberhasilan ekstraksi asam nukleat. Saat ini, tidak ada metode umum ekstraksi DNA atau RNA yang sesuai untuk digunakan dalam ekstraksi organisme prokariotik dan eukariotik. Selain itu masalah lainnya yaitu urgensi dalam memperoleh DNA bebas-RNA dengan menghadirkan RNase namun tidak mengandung DNase, untuk mencegah degradasi DNA.
Teknik-Teknik Ekstraksi Asam Nukleat
Ekstraksi Sentrifugasi Gradien Densitas Cesium Klorida/Etidium Bromida
Metode awal ini merupakan metode ekstraksi awal yang ditemukan pada tahun 1950. Prinsip dasar metode ini yaitu pemanfaatan perbedaan densitas antara ion cesium dan air dengan interkalasi EtBr yang menghasilkan pemisahan berbagai DNA dan hasil DNA yang bayank. Keterbatasan metode ini yaitu memerlukan ultrasentrifugasi dengan biaya mahal yang membutuhkan kerja keras dan sulit diaplikasikan, di samping membutuhkan banyak waktu dan EtBr karsinogenik.
Ekstraksi Fenol-Kloroform
Ekstraksi fenol-kloroform adalah metode lain yang telah banyak digunakan. Prosesnya terdiri dari pencampuran larutan fenol-kloroform dengan sampel dilanjutkan dengan sentrifugasi. Proses ini memungkinkan isolasi asam nukleat yang larut dalam campuran kloroform dan fenol. Fenol tidak sepenuhnya menghambat aktivitas RNase. Setelah sentrifugasi, fase air (bagian atas) yang mengandung DNA dapat dipisahkan dari fase organi (bagian bawah) yang mengandung protein terdenaturasi dan DNA yang dapat dipresipitasi dengan menambahkan etanol atau isopropanol dengan konsentrasi garam yang tinggi. Setelah pencucian dengan etanol 70% untuk menghilangkan sisa etanol atau isopropanol, DNA target akhir dikumpulkan dengan melarutkan dalam buffer TE atau aquabidest. Metode ini juga digunakan untuk ekstraksi RNA dengan menggunakan guanidinium isothiocyanate secara bersamaan. Keterbatasan metode ini adalah fenol yang bersifat toksik, kaustik, dan mudah terbakar terlebih lagi digunakan dalam laboratorium diagnostik.
Ekstraksi Fase Padat
Metode ini menggunakan partikel silika yang tidak larut dibandingkan fenol cair. Partikel inti silika memiliki peran serupa seperti fenol namun dengan keunggulan utama yaitu lebih aman, dan cross-contamination dapat dikurangi. Presipitasi DNA dapat meminimalisir DNA yang hilang akibat presipitasi dengan fenol/kloroform. Kit komersial juga beberapa menggunakan partikel silika tersebut, meskipun juga telah digantikan oleh bahan lain seperti matriks silika, partikel kaca, tanah diatom, dan anion-exchange carrier.
Ekstraksi fase padat menggunakan kolom spin yang dioperasikan dengan sentrifugasi, memungkinkan DNA dipurifikasi dengan cepat, efisien, dan kuantitatif. Sentrifugasi dengan fase padat tidak mempunyai batasan ekstraksi cair sekaligus memperkecil probabilitas pemisahan yang tidak sempurna. Ekstraksi fase padat menggunakan silika sekarang adalah salah satu metode yang paling umum untuk ekstraksi asam nukleat. Silika yang bermuatan positif berikatan kuat dengan DNA yang bermuatan negatif.
Penggunaan tanah diatom didesain dengan menjadikan tanah tersebut sebagai matriks untuk ekstraksi fase padat. Prinsip metode adalah dengan imobilisasi DNA karena adanya agen chaotropic. Teknik dengan tanah diatom dapat memurnikan rRNA dan DNA.
Ekstraksi dengan Magnetic Bead
Modifikasi ekstraksi fase padat yang paling terbaru yaitu penggunaan magnetic bead. Bead yang bermuatan negatif di permukaannya akan mengikat protein dan debris seluler secara selektif. Setelah itu, DNA dapat diisolasi dengan mudah dari spesimen. Keuntungan penggunaan teknik ini yaitu mengurangi sentrifugasi, filtrasi vakum, dan pemisahan kolom berulang untuk proses pencucian dan elusi serta pelarut organik. Metode magnetic bead sangat sederhana dan nyaman sehingga banyak kit komersial yang menggunakan metode ini Selain metode ini, metode enzimatik adalah contoh dari metode ekstraksi yang paling baru yang membantu peneliti dengan memberikan kemudahan dengan volume spesimen kecil sekaligus mampu meningkatkan recovery DNA.
Teknologi Klinis dan Kit Ekstraksi Komersial dari MAGEN
Ekstraksi asam nukleat adalah langkah pertama dan paling penting untuk metode amplifikasi yang digunakan untuk mendeteksi gen organisme atau patogen. Metode ini adalah langkah penting dalam diagnostik molekuler yang memastikan hasil relevan secara klinis. Ekstraksi asam nukleat terdiri dari tiga proses utama: isolasi, purifikasi, dan konsentrasi. Kit ekstraksi komersial biasanya digunakan untuk mempermudah kegiatan di laboratorium klinis.
Syarat-syarat penting yang diperlukan dalam kit ekstraksi asam nukleat adalah sebagai berikut:
- ekstraksi harus sederhana dan cepat dengan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi;
- lebih diminati karena tidak ada peralatan khusus atau pengetahuan/keterampilan khusus;
- hasil ekstrak asam nukleat harus murni dan mudah dimodifikasi untuk berbagai teknik amplifikasi;
- reagen dan komponen kit tidak berbahaya;
- proses preparasi harus tidak sesuai terhadap kontaminasi dengan spesimen lain.
Ketika berurusan dengan spesimen klinis, harus selalu mempertimbangkan eliminasi inhibitor DNA polimerase dan patogenisitas dari patogen berbahaya, serta recovery target dan integritas asam nukleat yang baik.
Dalam ekstraksi DNA atau RNA, asam nukleat tersebut biasanya diekstraksi dari spesimen darah, sputum (dahak), tinja, urin, jaringan, atau cairan serebrospinal. Selain perbedaan spesimen, perbedaan jenis organisme juga menentukan bagaimana seleksi proses ekstraksi asam nukleat tersebut. Misalnya, bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dibanding bakteri gram negatif sehingga metode yang digunakan akan sedikit berbeda. Penting untuk diingat bahwa apabila tujuan ekstraksi adalah asam nukleat patogen dari spesimen manusia, maka ekstraksi asam nukleat patogen juga akan mengandung DNA/RNA manusia sehingga recovery target berkurang karena adanya DNA manusia.
Kami disini menghadirkan berbagai jenis kit yang dapat digunakan berdasarkan kebutuhan sesuai dengan target asam nukleat (DNA atau RNA) yang dituju. MAGEN (Angen Biotech Co., Ltd) merupakan manufacture produk teknik genetika molekuler yang secara kualitas bersaing dengan brand ternama, seperti Qiagen dan Invitrogen.
